Artikal h postavljen malo dalje od prednjeg fokusa objektiva. Objektiv daje pravi, inverzni, uvećani slika H’ , koji se nalazi između prednjeg fokusa okulara i optičkog središta okulara. Ta se međuslika promatra kroz okular kao kroz povećalo. Okular daje imaginaran, izravan, uvećan slika H, koji se nalazi na udaljenosti najboljeg vida S ≈ 25 cm od optičkog središta oka.
Tu sliku gledamo svojim očima i ona se formira na njezinoj mrežnici. pravi, inverzni, reducirani slika.
Povećanje mikroskopa– omjer dimenzija virtualne slike i dimenzija objekta promatranog kroz mikroskop: 
. Pomnožite brojnik i nazivnik s veličinom međuslike H’
:
. Dakle, povećanje mikroskopa jednako je umnošku povećanja objektiva i povećanja okulara. Povećanje objektiva može se izraziti u smislu karakteristika mikroskopa pomoću sličnosti pravokutnih trokuta 
, Gdje L
optički
duljina cijevi: udaljenost između stražnjeg fokusa leće i prednjeg fokusa okulara (pretpostavljamo da L
>> F oko). Povećanje okulara
. Dakle, povećanje mikroskopa je: 
.
4. Razlučivost i granica razlučivosti mikroskopa. Difrakcijski fenomeni u mikroskopu, pojam Abbeove teorije.
Granica rezolucije mikroskopaz - ovo je najmanja udaljenost između dviju točaka predmeta promatranih kroz mikroskop, kada se te točke još uvijek percipiraju odvojeno. Granica rezolucije konvencionalnog biološkog mikroskopa je u rasponu od 3-4 mikrona. Rezolucija mikroskop je sposobnost pružanja zasebne slike dviju blisko smještenih točaka predmeta koji se proučava, to jest, ovo je recipročna vrijednost granice razlučivosti.
Difrakcija svjetlosti ograničava sposobnost razlikovanja detalja predmeta kada se promatraju kroz mikroskop. Budući da se svjetlost ne širi pravocrtno, već se savija oko prepreka (u ovom slučaju predmeta o kojima je riječ), slike sitnih detalja predmeta ispadaju mutne.
E. Abbe je predložio difrakcijska teorija rezolucije mikroskopa. Neka objekt koji želimo promatrati kroz mikroskop bude difrakcijska rešetka s periodom d. Tada će minimalni detalj objekta koji moramo razlikovati biti upravo period rešetke. Do difrakcije svjetlosti dolazi na rešetki, ali je promjer objektiva mikroskopa ograničen, a pri velikim kutovima difrakcije ne ulazi sva svjetlost koja prolazi kroz rešetku u objektiv. U stvarnosti se svjetlost s predmeta širi prema leći u određenom stošcu. Rezultirajuća slika je bliža izvorniku što je više maksimuma uključeno u formiranje slike. Svjetlost s predmeta širi se do leće iz kondenzora u obliku stošca koji karakterizira kutni otvor
u- kut pod kojim je leća vidljiva iz središta promatranog objekta, odnosno kut između vanjskih zraka stožaste svjetlosne zrake koja ulazi u optički sustav. Prema E. Abbeu, da bi se dobila slika rešetke, čak i ona najnejasnija, u leću moraju ući zrake bilo koja dva reda difrakcijskog uzorka, na primjer, zrake koje tvore središnji i barem prvi difrakcijski maksimum. Podsjetimo se da za kosi upad zraka na difrakcijsku rešetku njegova glavna formula ima oblik: . Ako svjetlost dolazi pod kutom 
, i difrakcijski kut za prvi maksimum jednaki 
, tada formula poprima oblik 
. Granicu rezolucije mikroskopa treba uzeti kao konstantu difrakcijske rešetke 
, gdje je valna duljina svjetlosti.
Kao što se može vidjeti iz formule, jedan od načina da se smanji granica rezolucije mikroskopa je korištenje svjetla s kraćom valnom duljinom. U tom smislu koristi se ultraljubičasti mikroskop, u kojem se mikroobjekti ispituju u ultraljubičastim zrakama. Osnovni optički dizajn takvog mikroskopa sličan je onom konvencionalnog mikroskopa. Glavna razlika je korištenje optičkih uređaja koji su prozirni za UV svjetlo i značajke registracije slike. Budući da oko ne percipira ultraljubičasto zračenje (osim toga, ono peče oči, tj. opasno je za organ vida), koriste se fotografske ploče, fluorescentni zasloni ili elektrooptički pretvarači.
Ako poseban tekući medij tzv uranjanje, onda se granica rezolucije također smanjuje: 
, Gdje n– apsolutni indeks loma uranjanja, A
– numerički otvor objektiva. Voda se koristi za uranjanje ( n
=
1.33), cedrovo ulje ( n= 1,515), monobromnaftalen ( n
=
1.66) itd. Za svaku vrstu imerzije izrađuje se posebna leća, koja se može koristiti samo s ovom vrstom imerzije.
Drugi način smanjenja granice rezolucije mikroskopa je povećanje kuta otvora. Taj kut ovisi o veličini leće i udaljenosti objekta od leće. Međutim, udaljenost od predmeta do leće ne može se proizvoljno mijenjati; ona je konstantna za svaku leću i predmet se ne može približiti. U modernim mikroskopima, kut otvora doseže 140 o (odnosno, u/2 = 70 o). S ovim kutom se postižu maksimalne numeričke aperture i minimalne granice rezolucije.
Podatak je dat za kosi pad svjetlosti na objekt i valnu duljinu od 555 nm, na koju je ljudsko oko najosjetljivije.
Imajte na umu da okular uopće ne utječe na rezoluciju mikroskopa, on samo stvara uvećanu sliku leće.
Tehnički je moguće izraditi optičke mikroskope čije će leće i okulari omogućiti ukupno povećanje od 1500-2000 ili više. Međutim, to je nepraktično, budući da je sposobnost razlikovanja malih detalja objekta ograničena fenomenom difrakcije. Kao rezultat toga, slika najmanjih detalja objekta gubi oštrinu, može doći do kršenja geometrijske sličnosti slike i objekta, susjedne točke će se spojiti u jednu, a slika može potpuno nestati. Stoga u optici postoje sljedeći pojmovi koji karakteriziraju kvalitetu mikroskopa:
Rezolucija mikroskopa- svojstvo mikroskopa da pruži zasebnu sliku malih detalja predmeta koji se razmatra.
Granica razlučivosti- ovo je najmanji razmak između dviju točaka koje su zasebno vidljive mikroskopom.
Što je niža granica rezolucije, veća je rezolucija mikroskopa!
Granica razlučivosti određuje najmanju veličinu detalja koji se mogu razaznati u uzorku pomoću mikroskopa.
Teoriju razlučivosti mikroskopa razvio je direktor tvornice K. Zeiss u Jeni, profesor optike E. Abbe (1840.-1905.). Kao jednostavan mikroskopski uzorak uzeo je difrakcijsku rešetku (slika 2), proučavao mehanizam stvaranja slike u mikroskopu i pokazao sljedeće.
Predstavimo koncept kut otvora- ovo je kut između vanjskih zraka konusne svjetlosne zrake koja dolazi iz sredine objekta u leću (Sl. 3, A). Za stvaranje slike, odnosno za razlučivanje objekta, dovoljno je da leća barem s jedne strane primi zrake koje tvore samo maksimume nultog i prvog reda (sl. 2 i 3, b). Sudjelovanje zraka iz većeg broja maksimuma u formiranju slike povećava kvalitetu slike i njen kontrast. Stoga zrake koje tvore ove maksimume moraju biti unutar kuta otvora leće.
 |
a) b) c) d)
1 - prednja leća, 2 - leća
Dakle, ako je objekt difrakcijska rešetka s periodom d i svjetlost normalno pada na njega (sl. 2 i 3, b), tada zrake koje tvore maksimume nultog i prvog reda s obje strane moraju nužno sudjelovati u formiranju slike, a kut j 1 je kut odstupanja zraka koji tvore maksimum prvog reda, prema tome; u ekstremnim slučajevima mora biti jednak kutu U/2.
Ako uzmemo rešetku s manjim periodom d’, tada će kut j’ 1 biti veći od kuta U/2 i slika se neće pojaviti. To znači period rešetke d može se uzeti kao granica rezolucije mikroskopa Z. Zatim, koristeći formulu difrakcijske rešetke, pišemo za k=1:
Zamjena d na Z, i j 1 dalje U/2, dobivamo
. (6)
Tijekom mikroskopije, svjetlosne zrake pogađaju predmet pod različitim kutovima. S kosim upadom zraka (sl. 3, G) granica rezolucije se smanjuje, budući da će samo zrake koje tvore maksimume nultog reda i prvog reda s jedne strane sudjelovati u formiranju slike, a kut j 1 bit će jednak kutu otvora blende U. Izračuni pokazuju da formula za granicu rezolucije u ovom slučaju ima sljedeći oblik:
. (7)
Ako je prostor između predmeta i leće ispunjen imerzijskim sredstvom s indeksom loma n, koja je veća od indeksa loma zraka, zatim valna duljina svjetlosti l n= l ¤ n. Zamjenom ovog izraza u formulu za granicu rezolucije (7), dobivamo
, ili 
. (8)
Dakle, formula (7) određuje granicu rezolucije za mikroskop sa suhim objektivom, a formula (8) za mikroskop s imerzijskim objektivom. Vrijednosti sin 0,5 U I n× grijeh0.5 U u ovim se formulama naziva numerički otvor leće i označava se slovom A. Uzimajući to u obzir, formula za granicu rezolucije mikroskopa u općem obliku je napisana kako slijedi:
Kao što je vidljivo iz formula (8) i (9), razlučivost mikroskopa ovisi o valnoj duljini svjetlosti, kutu otvora, indeksu loma medija između leće i predmeta, kutu upada svjetlosnih zraka. na objektu, ali ne ovisi o parametrima okulara. Okular ne daje nikakve dodatne informacije o strukturi objekta, ne poboljšava kvalitetu slike, već samo povećava međusliku.
Razlučivost mikroskopa može se povećati primjenom imerzije i smanjenjem valne duljine svjetlosti. Povećanje razlučivosti pri korištenju imerzije može se objasniti na sljedeći način. Ako se između leće i predmeta nalazi zrak (suha leća), tada svjetlosna zraka pri prelasku iz pokrovnog stakla u zrak, medij s nižim indeksom loma, zbog loma bitno mijenja smjer, pa je manje zraka ući u objektiv. Pri korištenju imerzijskog medija, čiji je indeks loma približno jednak indeksu loma stakla, ne uočava se promjena putanje zraka u mediju i više zraka ulazi u leću.
Voda se koristi kao tekućina za uranjanje ( n=1,33), cedrovo ulje ( n=1,515), itd. Ako maksimalni kut otvora blende za moderne leće dosegne 140 0, tada za suhu leću A=0,94, a za leću s uljnom imerzijom A=1,43. Ako u izračunu koristimo valnu duljinu svjetlosti l = 555 nm, na koju je oko najosjetljivije, tada će granica razlučivosti suhe leće biti 0,30 µm, a s uronjenjem u ulje - 0,19 µm. Numerička vrijednost otvora blende naznačena je na cijevi objektiva: 0,20; 0,40; 0,65 itd.
Povećanje rezolucije optičkog mikroskopa smanjenjem valne duljine svjetlosti postiže se korištenjem ultraljubičastog zračenja. U tu svrhu postoje posebni ultraljubičasti mikroskopi s kvarcnom optikom i uređaji za promatranje i fotografiranje objekata. Budući da ovi mikroskopi koriste svjetlo s valnom duljinom približno upola manjom od vidljive svjetlosti, oni su sposobni razlučiti strukture lijeka s dimenzijama od oko 0,1 μm. Ultraljubičasta mikroskopija ima još jednu prednost - može se koristiti za ispitivanje neobojanih preparata. Većina bioloških objekata prozirna je u vidljivom svjetlu jer ga ne apsorbira. Međutim, oni imaju selektivnu apsorpciju u ultraljubičastom području i stoga su lako vidljivi pod ultraljubičastim zrakama.
Elektronski mikroskop ima najveću rezoluciju, jer je valna duljina elektrona koji se kreće 1000 puta manja od valne duljine svjetlosti.
Korisno povećanje mikroskopa ograničena svojom moći razlučivanja i moći razlučivosti oka.
Razlučivost oka karakterizira najmanji vidni kut pod kojim ljudsko oko još uvijek može odvojeno razlikovati dvije točke predmeta. Ograničen je difrakcijom na zjenici i razmakom između stanica mrežnice osjetljivih na svjetlost. Za normalno oko, najmanji vidni kut je 1 minuta. Ako je predmet na udaljenosti najbolje vidljivosti - 25 cm, tada ovaj kut odgovara objektu veličine 70 mikrona. Ova se vrijednost smatra granicom rezolucije golog oka Zr na najboljoj udaljenosti gledanja. Međutim, pokazalo se da je optimalna vrijednost Zr jednako 140-280 mikrona. U ovom slučaju oko doživljava najmanje naprezanja.
Korisno povećanje mikroskopa oni to nazivaju maksimalnim povećanjem pri kojem je oko još uvijek u stanju razlikovati detalje koji su po veličini jednaki granici rezolucije mikroskopa.
Linearno povećanje mikroskopa jednako je omjeru veličine slike predmeta koji se nalazi na udaljenosti najboljeg vida i veličine samog objekta (vidi formulu 1). Ako granicu rezolucije mikroskopa uzmemo kao veličinu predmeta Z, a za veličinu slike - granica rezolucije golog oka na udaljenosti najboljeg vida Zr, tada dobivamo formulu za korisno povećanje mikroskopa:
Zamjenom u ovu formulu Z iz izraza (9) dobivamo
. (11)
Zamjenom u formulu (11) valne duljine svjetlosti od 555 nm (555×10 -9 m), optimalne vrijednosti granica razlučivosti oka su 140-280 µm (140-280×10 -6 m), nalazimo raspon korisnih vrijednosti povećanja mikroskopa
500 A < DO n< 1000 A .
Na primjer, kada se koriste najbolji imerzijski objektivi s numeričkom aperturom od 1,43, korisno povećanje će biti 700-1400, što pokazuje da nije praktično dizajnirati optičke mikroskope s velikim povećanjem. Međutim, trenutno je ovo pitanje izgubilo svoju hitnost zbog široke upotrebe u biologiji i medicini elektronskog mikroskopa, koji omogućuje povećanje do 600 000 i granicu razlučivosti do 0,1 nm.
Svrha rada. Upoznavanje s uređajem mikroskopa i određivanje njegove rezolucije.
Uređaji i pribor: Mikroskop, metalna pločica s rupom, ogledalo za osvjetljavanje, ravnalo sa skalom.
Uvod
Mikroskop se sastoji od objektiva i okulara, koji su složeni sustavi leća. Put zraka u mikroskopu prikazan je na slici 1, na kojoj su objektiv i okular predstavljeni jednom lećom.
Predmet AB postavljen je nešto dalje od glavnog fokusa leće F oko. Leća mikroskopa daje stvarnu, inverznu i uvećanu sliku predmeta (AB na slici 1.), koja se formira iza dvostruke žarišne duljine leće. Uvećanu sliku okular promatra kao povećalo. Slika predmeta gledana kroz okular je virtualna, inverzna i uvećana.
Udaljenost između stražnjeg fokusa leće i prednjeg fokusa okulara naziva se optički razmak sustava ili duljina optičke cijevi mikroskop .
Povećanje mikroskopa može se odrediti povećanjem objektiva i okulara:
N = N oko N oko = ───── (1)
f oko f u redu
gdje su N o i N o povećanje objektiva i okulara; D - udaljenost najboljeg vida za normalno oko (~25 cm); je optička duljina tubusa mikroskopa; f oko i f U REDU- glavne žarišne duljine leće i okulara.
Analizirajući formulu (1), možemo zaključiti da mikroskopi s velikim povećanjem mogu pregledati sve male predmete. Međutim, korisno povećanje koje omogućuje mikroskop ograničeno je fenomenom difrakcije, koji postaje uočljiv kada se promatraju objekti čije su dimenzije usporedive s valnom duljinom svjetlosti.
Granica razlučivosti mikroskop je najmanji razmak između točaka čija se slika zasebno dobiva u mikroskopu.
Prema Abbeovoj teoriji, granica rezolucije mikroskopa određena je izrazom:
d = ───── (2)
gdje je d linearna veličina predmetnog objekta; - valna duljina korištene svjetlosti; n je indeks loma medija između predmeta i leće; je kut između glavne optičke osi mikroskopa i granične zrake (slika 2).
U 
naziva se veličina A = nsin numerički otvor objektiva
, a recipročna vrijednost d je rezolucija mikroskopa
. Iz izraza (2) proizlazi da rezolucija mikroskopa ovisi o numeričkom otvoru leće i valnoj duljini svjetlosti koja osvjetljava predmetni predmet.
Ako je predmet u zraku (n=1), tada je u mikroskopu moguće razlikovati točke objekta čija je udaljenost:
d = ─────
Za mikroskopske objekte kut je blizu 90 stupnjeva, zatim sin 1, što znači da se predmeti koji se nalaze na međusobnoj udaljenosti ~ 0,61 mogu pregledati mikroskopom. U slučaju vizualnih promatranja (maksimalna osjetljivost oka javlja se u zelenom području vidljivog spektra 550 nm), mikroskopom se mogu vidjeti objekti koji se nalaze na udaljenosti od ~300 nm.
Kao što slijedi iz izraza (2), rezolucija mikroskopa može se povećati smanjenjem valne duljine svjetlosti koja osvjetljava predmet. Tako se pri fotografiranju predmeta u ultraljubičastom svjetlu (~ 250-300 nm) rezolucija mikroskopa može udvostručiti.
Kao što znate, osoba prima većinu informacija o svijetu oko sebe kroz vid. Ljudsko oko je složen i savršen uređaj. Ovaj uređaj koji je stvorila priroda radi sa svjetlom - elektromagnetskim zračenjem čiji je raspon valnih duljina između 400 i 760 nanometara. Boja koju čovjek percipira mijenja se od ljubičaste do crvene.
Elektromagnetski valovi koji odgovaraju vidljivom svjetlu u interakciji su s elektroničkim ljuskama atoma i molekula u oku. Rezultat te interakcije ovisi o stanju elektrona u tim ljuskama. Svjetlo se može apsorbirati, reflektirati ili raspršiti. Što se točno dogodilo sa svjetlom može puno reći o atomima i molekulama s kojima je došlo u interakciju. Raspon veličina atoma i molekula je od 0,1 do desetaka nanometara. To je mnogo puta kraće od valne duljine svjetlosti. Međutim, objekte upravo te veličine - nazovimo ih nanoobjekti - vrlo je važno vidjeti. Što za to treba učiniti? Prvo raspravimo što ljudsko oko može vidjeti.
Obično se, kada se govori o razlučivosti pojedinog optičkog uređaja, operira s dva pojma. Jedna je kutna, a druga linearna rezolucija. Ovi pojmovi su međusobno povezani. Na primjer, za ljudsko oko, kutna rezolucija je približno 1 kutna minuta. U ovom slučaju oko može razlikovati dva točkasta objekta udaljena 25-30 cm od njega samo ako je udaljenost između tih objekata veća od 0,075 mm. To je prilično usporedivo s razlučivošću konvencionalnog računalnog skenera. Zapravo, razlučivost od 600 dpi znači da skener može razlikovati točke udaljene čak 0,042 mm.
Kako bi se mogli razlikovati predmeti koji se nalaze na još manjim međusobnim udaljenostima, izumljen je optički mikroskop - uređaj koji povećava rezoluciju oka. Ovi uređaji izgledaju drugačije (kao što se vidi na slici 1), ali im je princip rada isti. Optički mikroskop omogućio je pomicanje granice rezolucije na djeliće mikrona. Već prije 100 godina optička mikroskopija omogućila je proučavanje mikronskih objekata. Međutim, istodobno je postalo jasno da je nemoguće postići daljnje povećanje rezolucije jednostavnim povećanjem broja leća i poboljšanjem njihove kvalitete. Pokazalo se da je rezolucija optičkog mikroskopa ograničena svojstvima same svjetlosti, točnije njenom valnom prirodom.
Krajem pretprošlog stoljeća utvrđeno je da je rezolucija optičkog mikroskopa . U ovoj formuli λ je valna duljina svjetlosti i n grijeh u- numerička apertura mikroskopske leće, koja karakterizira i mikroskop i tvar koja se nalazi između predmeta proučavanja i mikroskopske leće koja mu je najbliža. Doista, izraz za numeričku aperturu uključuje indeks loma n okruženje između predmeta i leće te kut u između optičke osi leće i krajnjih vanjskih zraka koje izlaze iz predmeta i mogu ući u tu leću. Indeks loma vakuuma jednak je jedinici. Za zrak je ovaj pokazatelj vrlo blizu jedinici, za vodu je 1,33303, a za posebne tekućine koje se koriste u mikroskopiji za postizanje maksimalne rezolucije, n doseže 1,78. Bez obzira na kut u, vrijednost sin u ne može biti više od jednog. Dakle, rezolucija optičkog mikroskopa ne prelazi djelić valne duljine svjetlosti.
Razlučivost se općenito smatra pola valne duljine.
Intenzitet, rezolucija i povećanje objekta su različite stvari. Možete napraviti tako da razmak između središta slika objekata koji se nalaze 10 nm jedan od drugog bude 1 mm. To bi odgovaralo povećanju od 100.000 puta. No, neće se moći razlučiti radi li se o jednom objektu ili o dva. Činjenica je da će slike objekata čije su dimenzije vrlo male u usporedbi s valnom duljinom svjetlosti imati isti oblik i veličinu, neovisno o obliku samih objekata. Takvi objekti nazivaju se točkasti objekti - njihove se veličine mogu zanemariti. Ako takav točkasti objekt svijetli, tada će ga optički mikroskop prikazati kao svijetli krug okružen svijetlim i tamnim prstenovima. Dalje ćemo, radi jednostavnosti, razmotriti izvore svjetlosti. Tipična slika točkastog izvora svjetlosti dobivena pomoću optičkog mikroskopa prikazana je na slici 2. Intenzitet svjetlosnih prstenova mnogo je manji od intenziteta kruga i smanjuje se s udaljenošću od središta slike. Najčešće je vidljiv samo prvi svijetli prsten. Promjer prvog tamnog prstena je . Funkcija koja opisuje ovu distribuciju intenziteta naziva se funkcija širenja točaka. Ova funkcija ne ovisi o povećanju. Slika nekoliko točkastih objekata bit će upravo krugovi i prstenovi, kao što se može vidjeti na slici 3. Rezultirajuća slika može se povećati, međutim, ako se spoje slike dvaju susjednih točkastih objekata, one će se i dalje spajati. Često se kaže da je ova vrsta povećanja beskorisna - veće slike će jednostavno biti mutnije. Primjer beskorisnog povećanja prikazan je na slici 4. Formula se često naziva difrakcijska granica, a toliko je poznata da je uklesana na spomenik autoru ove formule, njemačkom optičkom fizičaru Ernstu Abbeu.
Naravno, s vremenom su se optički mikroskopi počeli opremati raznim uređajima koji su omogućili pohranu slika. Ljudsko oko najprije je nadopunjeno filmskim kamerama i filmovima, a potom i kamerama temeljenim na digitalnim uređajima koji svjetlost koja pada na njih pretvaraju u električne signale. Najčešći od ovih uređaja su CCD matrice (CCD je kratica za uređaj s spregnutim nabojem). Broj piksela u digitalnim fotoaparatima i dalje raste, ali samo to ne može poboljšati razlučivost optičkih mikroskopa.
Još prije dvadeset i pet godina činilo se da je difrakcijska granica nepremostiva i da je za proučavanje objekata čije su dimenzije višestruko manje od valne duljine svjetlosti potrebno napustiti svjetlost kao takvu. Upravo tim putem krenuli su tvorci elektronskih i rendgenskih mikroskopa. Unatoč brojnim prednostima takvih mikroskopa, ostao je problem korištenja svjetla za promatranje nanoobjekata. Bilo je mnogo razloga za to: pogodnost i jednostavnost rada s objektima, kratko vrijeme potrebno za dobivanje slike, poznate metode za bojanje uzoraka i još mnogo toga. Napokon, nakon godina napornog rada, postalo je moguće promatrati objekte u nanosmjeru pomoću optičkog mikroskopa. Najveći napredak u tom smjeru postignut je u području fluorescentne mikroskopije. Naravno, nitko nije otkazao granicu difrakcije, ali su je uspjeli zaobići. Trenutno postoje različiti optički mikroskopi koji omogućuju ispitivanje objekata čije su dimenzije puno manje od valne duljine same svjetlosti koja stvara slike tih objekata. Svi ovi uređaji imaju zajednički princip. Pokušajmo objasniti koji je to.
Iz onoga što je već rečeno o difrakcijskoj granici rezolucije, jasno je da vidjeti točkasti izvor nije tako teško. Ako je ovaj izvor dovoljnog intenziteta, njegova će slika biti jasno vidljiva. Oblik i veličina ove slike, kao što je već spomenuto, bit će određen svojstvima optičkog sustava. U isto vrijeme, poznavajući svojstva optičkog sustava i sigurni da je objekt točkasti objekt, možete točno odrediti gdje se objekt nalazi. Točnost određivanja koordinata takvog objekta je prilično visoka. To se može ilustrirati slikom 5. Koordinate točkastog objekta mogu se točnije odrediti što on intenzivnije svijetli. Još 80-ih godina prošlog stoljeća pomoću optičkog mikroskopa uspjeli su odrediti položaj pojedinih svjetlećih molekula s točnošću od 10-20 nanometara. Nužan uvjet za tako točno određivanje koordinata točkastog izvora je njegova osamljenost. Najbliži drugi točkasti izvor mora biti toliko udaljen da istraživač sa sigurnošću zna da slika koja se obrađuje odgovara jednom izvoru. Jasno je da se radi o udaljenosti l mora zadovoljiti uvjet. U tom slučaju analizom slike mogu se dobiti vrlo precizni podaci o položaju samog izvora.
Većina objekata čije su dimenzije mnogo manje od rezolucije optičkog mikroskopa mogu se prikazati kao skup točkastih izvora. Izvori svjetlosti u takvom skupu nalaze se jedan od drugog na udaljenostima mnogo manjim od . Ako ti izvori zasjaju istovremeno, tada će biti nemoguće reći bilo što o tome gdje se točno nalaze. Međutim, ako možete učiniti da ti izvori svijetle redom, tada se položaj svakog od njih može odrediti s velikom točnošću. Ako ta točnost premašuje udaljenost između izvora, tada se, znajući položaj svakog od njih, može saznati koji su njihovi relativni položaji. To znači da je dobivena informacija o obliku i veličini objekta koji se prikazuje kao skup točkastih izvora. Drugim riječima, u ovom slučaju optičkim mikroskopom možete promatrati objekt čije su dimenzije manje od granice ogiba!
Dakle, ključna točka je dobiti informacije o različitim dijelovima nanoobjekta neovisno jedan o drugom. Postoje tri glavne skupine metoda za to.
Prva skupina metoda namjerno čini da jedan ili drugi dio predmeta koji se proučava zasja. Najpoznatija od ovih metoda je skenirajuća optička mikroskopija bliskog polja. Pogledajmo ga pobliže.
Ako pažljivo proučite uvjete koji se podrazumijevaju kada je u pitanju granica difrakcije, otkrit ćete da su udaljenosti od objekata do leća puno veće od valne duljine svjetlosti. Na udaljenostima koje su usporedive i manje od ove valne duljine, slika je drugačija. U blizini svakog objekta uhvaćenog u elektromagnetsko polje svjetlosnog vala postoji izmjenično elektromagnetsko polje čija je frekvencija promjene jednaka frekvenciji promjene polja u svjetlosnom valu. Za razliku od svjetlosnog vala, ovo polje brzo opada kako se udaljava od nanoobjekta. Udaljenost na kojoj se intenzitet smanjuje, npr. e puta, usporedivo s veličinom objekta. Dakle, elektromagnetsko polje optičke frekvencije ispada da je koncentrirano u volumenu prostora, čija je veličina mnogo manja od valne duljine svjetlosti. Bilo koji nanoobjekt koji padne u ovo područje će na ovaj ili onaj način stupiti u interakciju s koncentriranim poljem. Ako se objekt uz pomoć kojeg se provodi ova koncentracija polja uzastopno pomiče duž bilo koje putanje duž nanoobjekta koji se proučava i zabilježi se svjetlost koju emitira ovaj sustav, tada se slika može konstruirati iz pojedinačnih točaka koje leže na ovoj putanji. Naravno, u svakoj točki slika će izgledati kao što je prikazano na slici 2, ali rezolucija će biti određena time koliko je polje bilo koncentrirano. A to je, pak, određeno veličinom objekta uz pomoć kojega se ovo polje koncentrira.
Najčešći način koncentriranja polja na ovaj način je napraviti vrlo malu rupu u metalnom ekranu. Obično se ova rupa nalazi na kraju šiljastog svjetlovoda presvučenog tankim metalnim slojem (svjetlosvodnik se često naziva optičko vlakno i naširoko se koristi za prijenos podataka na velike udaljenosti). Sada je moguće proizvesti rupe promjera od 30 do 100 nm. Rezolucija je iste veličine. Uređaji koji rade na ovom principu nazivaju se skenirajući optički mikroskopi bliskog polja. Pojavili su se prije 25 godina.
Suština druge skupine metoda svodi se na sljedeće. Umjesto da okolni nanoobjekti redom svijetle, možete koristiti objekte koji svijetle različitim bojama. U ovom slučaju, uz pomoć svjetlosnih filtara koji prenose svjetlost jedne ili druge boje, možete odrediti položaj svakog objekta, a zatim stvoriti jednu sliku. Ovo je vrlo slično onome što je prikazano na slici 5, samo će boje biti različite za tri slike.
Posljednja skupina metoda koje omogućuju prevladavanje difrakcijske granice i ispitivanje nanoobjekata koriste svojstva samih svjetlećih objekata. Postoje izvori koji se mogu “paliti” i “gasiti” posebno odabranim svjetlom. Takva se prebacivanja događaju statistički. Drugim riječima, ako postoji mnogo promjenjivih nanoobjekata, tada odabirom valne duljine svjetlosti i njezinog intenziteta možete prisiliti samo dio tih objekata da se "isključe". Preostali objekti će nastaviti svijetliti, a iz njih se može dobiti slika. Nakon toga morate “upaliti” sve izvore i ponovno “ugasiti” neke od njih. Skup izvora koji ostaju "uključeni" razlikovat će se od skupa koji je ostao "uključen" prvi put. Ponavljanjem ovog postupka mnogo puta, možete dobiti veliki skup slika koje se razlikuju jedna od druge. Analizom takvog skupa moguće je locirati velik dio svih izvora s vrlo visokom točnošću, znatno iznad granice ogiba. Primjer tako dobivene super-razlučivosti prikazan je na slici 6.
Optička mikroskopija super rezolucije trenutno se brzo razvija. Za pretpostaviti je da će ovo područje idućih godina privlačiti sve veći broj istraživača, a nadamo se da će među njima biti i čitatelji ovog članka.
Smjernice
Za proučavanje predmeta koji su male veličine i nerazlučivi golim okom, koriste se posebni optički instrumenti - mikroskopi. Ovisno o namjeni, razlikuju se: pojednostavljeni, radni, istraživački i univerzalni. Prema korištenom izvoru osvjetljenja mikroskope dijelimo na: svjetlosne, fluorescentne, ultraljubičaste, elektronske, neutronske, skenirajuće, tunelske. Dizajn bilo kojeg od navedenih mikroskopa uključuje mehaničke i optičke dijelove. Mehanički dio služi za stvaranje uvjeta promatranja - postavljanje objekta, fokusiranje slike, optički dio - dobivanje uvećane slike.
Uređaj svjetlosnog mikroskopa
Mikroskop se naziva svjetlosni mikroskop jer omogućuje proučavanje predmeta u propuštenoj svjetlosti u svijetlom vidnom polju. (Sl. Vanjski pogled na Biomed 2) prikazuje opći pogled na mikroskop Biomed-2.
|
|
Mehanički dio mikroskopa sastoji se od baze mikroskopa, pomičnog postolja i okretnog uređaja.
Fokusiranje na objekt postiže se pomicanjem pozornice okretanjem gumba za grubo i fino podešavanje.
Grubo područje fokusiranja mikroskopa je 40 mm.
Kondenzor je montiran na nosač i smješten između pozornice objekta i kolektorske leće. Njegovo kretanje se vrši okretanjem gumba za podešavanje visine kondenzatora. Njegov opći izgled prikazan je na (sl.???) Kondenzor s dvije leće s otvorom blende od 1,25 osigurava osvjetljenje polja na objektu pri radu s lećama s povećanjem od 4 do 100 puta.
Stol za objekte montiran je na nosač. Koordinirano kretanje predmetnog stola moguće je rotiranjem ručki. Predmet je pričvršćen za stol pomoću držača droga. Držači se mogu pomicati jedan u odnosu na drugi.
Koordinate objekta i količina pomaka mjere se na ljestvicama podjeka 1 mm i nonijusu podjeka 0,1 mm. Raspon pomicanja objekta u uzdužnom smjeru je 60 mm, u poprečnom smjeru - 40 mm. Kondenzator
Kondenzator
Mikroskop je opremljen kondenzatorskom montažnom jedinicom s mogućnošću centriranja i pomicanja fokusa.
Osnovni mikroskop koristi univerzalni kondenzator ugrađen u držač; kada se koristi ulje za uranjanje, numerička apertura je 1,25.
Prilikom podešavanja osvjetljenja, glatka promjena numeričke aperture snopa zraka koje osvjetljavaju lijek provodi se pomoću dijafragme otvora.
Kondenzator je ugrađen u držač kondenzatora u fiksnom položaju i pričvršćen vijkom za zaključavanje.
Vijci za centriranje kondenzatora koriste se tijekom postupka podešavanja osvjetljenja za pomicanje kondenzora u ravnini okomitoj na optičku os mikroskopa dok se slika dijafragme polja centrira u odnosu na rubove vidnog polja.
Ručka kondenzatora za gore i dolje, koja se nalazi na lijevoj strani nosača držača kondenzatora, koristi se za podešavanje osvjetljenja za fokusiranje na sliku dijafragme polja.
Filtri su ugrađeni u rotirajući prsten koji se nalazi na dnu kondenzatora.
Optički dio mikroskopa
Sastoji se od sustava osvjetljenja i promatranja. Sustav rasvjete ravnomjerno osvjetljava vidno polje. Sustav za promatranje dizajniran je za povećanje slike promatranog objekta.
Sustav rasvjete
Nalazi se ispod stola za predmete. Sastoji se od kolektorske leće ugrađene u tijelo, koja je ušrafljena u otvor na bazi mikroskopa i grla u koje je ugrađena lampa. Utičnica za lampu ugrađena je unutar baze mikroskopa. Osvjetljivač mikroskopa napaja se iz mreže izmjenične struje preko tropolnog kabela za napajanje spojenog na napajanje utikačem. Lampa iluminatora uključuje se prekidačem koji se nalazi na dnu mikroskopa.
Sustav promatranja
Sastoji se od leća, nastavka za monokular i okulara.
Leće
Leće su najvažniji, najvrjedniji i najlomljiviji dio mikroskopa. O njima ovisi povećanje, razlučivost i kvaliteta slike. Oni su sustav međusobno centriranih leća zatvorenih u metalni okvir. Na gornjem kraju okvira nalazi se navoj kojim se leća montira u ležište revolvera. Prednja (najbliža objektu) leća u leći naziva se frontalna leća i jedina je u leći koja proizvodi povećanje. Sve ostale objektivne leće nazivamo korekcijskim lećama i služe za ispravljanje nedostataka u optičkoj slici.
Kada snop svjetlosnih zraka različitih valnih duljina prođe kroz leće, dolazi do obojenja slike duginim bojama – kromatske aberacije. Neravnomjeran lom zraka na zakrivljenoj površini leće dovodi do sferne aberacije, koja nastaje zbog neravnomjernog loma središnje i periferne zrake. Kao rezultat toga, točkasta slika izgleda kao mutan krug.
Leće uključene u komplet mikroskopa dizajnirane su za optičku cijev duljine 160 mm, visine 45 mm i debljine pokrovnog stakla od mm.
Objektivi s povećanjem većim od 10X opremljeni su okvirima s oprugom koji štite uzorak i prednje leće od oštećenja prilikom fokusiranja na površinu uzorka.
Na tijelo leće može se postaviti prsten u boji u skladu s povećanjem, kao i:
- numerička apertura;
- duljina optičke cijevi 160;
- debljina pokrovnog stakla 0,17, 0 ili －";
- vrsta uranjanja - ulje ULJE (MI) ili voda VI;
Objektivi s oznakom 0,17 namijenjeni su proučavanju preparata samo s pokrovnim staklima debljine 0,17 mm. Objektivi označeni 0 namijenjeni su proučavanju preparata samo bez zaštitnih stakala. Za ispitivanje preparata sa ili bez pokrovnog stakla mogu se koristiti objektivi malog povećanja (2,5 - 10), kao i imerzijski objektivi. Ovi objektivi označeni su ikonom －.
Okulari
Okular mikroskopa sastoji se od dvije leće: očne leće (gornja) i sabirne leće (donja). Između leća nalazi se dijafragma. Dijafragma blokira bočne zrake i propušta one blizu optičke osi, što pojačava kontrast slike. Svrha okulara je povećanje slike koju proizvodi leća. Okulari imaju vlastito povećanje od ×5, ×10, ×12,5, ×16 i ×20, što je naznačeno na okviru.
Izbor okulara ovisi o korištenom setu leća. Pri radu s akromatskim, ahrostigmatnim i akrofluarnim lećama preporučljivo je koristiti okulare s linearnim vidnim poljem ne većim od 20 mm, s plankromatnim i planapokromatnim lećama - okulare s linearnim vidnim poljem od 20; 22 i 26,5 mm.
Dodatno, mikroskop se može opremiti okularom WF10/22 sa skalom; vrijednost podjeljka ljestvice je 0,1 mm.
Karakteristike mikroskopa
Povećanje mikroskopa
Glavne karakteristike mikroskopa uključuju povećanje i rezoluciju. Ukupno povećanje mikroskopa definira se kao umnožak povećanja objektiva i povećanja okulara. Međutim, povećanje ne označava kvalitetu slike; ona može biti jasna ili nejasna. Jasnoću dobivene slike karakterizira razlučivost mikroskopa, tj. najmanju veličinu predmeta ili njihovih dijelova koji se mogu vidjeti pomoću ovog uređaja.
Ukupno povećanje G mikroskopa tijekom vizualnog promatranja određeno je formulom: G = βok × βok, gdje je:
βrev - povećanje leće (označeno na leći);
βok - povećanje okulara (označeno na okularu).
| Tablica 3 | Povećanje objektiva Povećanje mikroskopa i promatrano polje |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5/26* | 10/22 | 15/16* | ||||
| na objektu s okularom: | G | na objektu s okularom: | G | na objektu s okularom: | G | |
| 4 | 20 | 4,0 | 50 | 4,5 | 64 | 3,75 |
| 10 | 50 | 2,0 | 100 | 1,8 | 160 | 1,5 |
| 20 | 100 | 1,0 | 200 | 0,9 | 320 | 0,75 |
| 40 | 200 | 0,5 | 420 | 0,45 | 640 | 0,38 |
| 100 | 500 | 0,2 | 1000 | 0,18 | 1600 | 0,15 |
- Dodaj, mm
Rezolucija mikroskopa
Razlučivost mikroskopa određena je minimalnom (razlučujućom) udaljenošću između dvije točke (ili dvije najtanje linije) vidljive odvojeno, a izračunava se formulom
D=λ/(A1+A2) , gdje je d najmanja (rezolucija) udaljenost između dvije točke (pravci);
λ je valna duljina korištene svjetlosti;
A1 i A2 su numerički otvor objektiva (označen na njegovom okviru) i kondenzora.
Možete povećati rezoluciju (tj. smanjiti apsolutnu vrijednost d, jer su to recipročne vrijednosti) na sljedeće načine: osvijetliti objekt svjetlom kraće valne duljine λ (primjerice ultraljubičastim ili kratkovalnim zrakama), koristiti leće s veći otvor blende A1 ili povećanje otvora kondenzora A2.
Radna udaljenost objektiva
Mikroskopi su opremljeni s četiri uklonjiva objektiva s vlastitim povećanjem od 4×, 10×, 40× i 100×, označenim na metalnom okviru. Povećanje leće ovisi o zakrivljenosti glavne prednje leće: što je veća zakrivljenost, to je kraća žarišna duljina i veće je povećanje. To se mora zapamtiti pri mikroskopiranju - što je veće povećanje koje daje leća, to je manja slobodna radna udaljenost i treba je spustiti niže iznad ravnine uzorka.
Uranjanje
Sve leće se dijele na suhe i imerzijske, odnosno potopne. Leća se naziva suhom ako između prednje leće i predmetnog uzorka ima zraka. U tom slučaju, zbog razlike u indeksu loma stakla (1,52) i zraka (1,0), dio svjetlosnih zraka se odbija i ne ulazi u oko promatrača. Leće suhog sustava obično imaju veliku žarišnu duljinu i pružaju malo (10x) ili srednje (40x) povećanje.
Mikroskop je spojen na električnu mrežu pomoću strujnog kabela. Uz pomoć revolvera, na putanju snopa ugrađuje se leća s povećanjem ×10. Lagano zaustavljanje i škljocanje revolverske opruge pokazuju da je leća postavljena duž optičke osi. Pomoću gumba za grubo fokusiranje spustite leću na udaljenost od 0,5 - 1,0 cm od pozornice.
Pravila za rad sa suhim lećama.
Pripremljeni preparat postavlja se na pozornicu i učvršćuje stezaljkom. Pomoću suhe leće ×10 gledaju se više vidnih polja. Pozornica se pomiče pomoću bočnih vijaka. Područje lijeka potrebno za ispitivanje postavlja se u središte vidnog polja. Podići tubus i okretanjem revolvera pomicati leću s povećanjem ×40, promatrajući sa strane makrometrijskim vijkom ponovno spuštati tubus s lećom gotovo do dodira s preparatom. Pogledajte u okular i vrlo polako podižite tubus dok se ne pojave konture slike. Precizno fokusiranje se provodi pomoću mikrometarskog vijka, okrećući ga u jednom ili drugom smjeru, ali ne više od jednog punog okretaja. Ako se pri okretanju mikrometarskog vijka osjeti otpor, to znači da je njegov hod završen. U tom slučaju okrenite vijak jedan ili dva puna kruga u suprotnom smjeru, ponovno pronađite sliku pomoću makrometrijskog vijka i nastavite s radom s mikrometrijskim vijkom.
Korisno je naviknuti se da pri mikroskopiranju oba oka budu otvorena i koristiti ih naizmjenično jer ćete tako manje zamarati vid.
Pri mijenjanju leća ne treba zaboraviti da rezolucija mikroskopa ovisi o omjeru otvora leće i kondenzora. Numerička apertura objektiva s povećanjem ×40 je 0,65, a neuronjenog kondenzora 0,95. Oni se praktički mogu uskladiti sljedećom tehnikom: nakon fokusiranja uzorka lećom, izvadite okular i, gledajući kroz tubus, pokrijte iris dijafragmu kondenzora sve dok njezini rubovi ne postanu vidljivi na rubu jednoliko osvijetljene stražnje strane. leća leće. U ovoj će točki numerički otvori kondenzora i objektiva biti približno jednaki.
Pravila za rad s imerzijskom lećom.
Na preparat (po mogućnosti fiksiran i obojen) nanese se mala kap imerzijskog ulja. Revolver se okreće i uzduž središnje optičke osi postavlja se imerzijska leća s povećanjem od 100×. Kondenzator se podiže dok se ne zaustavi. Iris dijafragma kondenzatora je potpuno otvorena. Gledajući sa strane, makrometrijskim vijkom spuštajte tubus sve dok leća ne bude uronjena u ulje, gotovo dok leća ne dođe u dodir s stakalcem uzorka. To morate učiniti vrlo pažljivo kako se prednja leća ne bi pomaknula i oštetila. Gledaju u okular, vrlo polako okreću makrometrijski vijak prema sebi i, ne dižući leću iz ulja, podižu tubus dok se ne pojave konture predmeta. Treba imati na umu da je slobodna radna udaljenost u imerzijskom objektivu 0,1 - 0,15 mm. Zatim se pomoću makrometrijskog vijka vrši precizno fokusiranje. U pripremi se ispituje nekoliko vidnih polja, pomičući stol s bočnim vijcima. Po završetku rada s imerzijskom lećom, podignite cijev, uklonite preparat i pažljivo obrišite prednju leću leće, prvo suhom mekom pamučnom salvetom, zatim istom salvetom, ali malo navlaženom čistim benzinom. Ne smijete ostavljati ulje na površini leće jer ono omogućuje taloženje prašine i s vremenom može dovesti do oštećenja optike mikroskopa. Preparat se prvo očisti od ulja komadićem filter papira, zatim se staklo tretira benzinom ili ksilolom.
Učitavanje...
