Articol h plasat puțin mai departe decât focalizarea frontală a lentilei. Lentila dă real, invers, augmentat imagine H’ , situat între focalizarea frontală a ocularului și centrul optic al ocularului. Această imagine intermediară este privită prin ocular ca printr-o lupă. Ocularul dă imaginar, direct, mărit imagine H, care este situat la distanța de cea mai bună vedere S ≈ 25 cm de centrul optic al ochiului.
Privim această imagine cu ochii și se formează pe retină. real, invers, redus imagine.
Mărirea microscopului– raportul dintre dimensiunile imaginii virtuale și dimensiunile obiectului văzut la microscop: 
. Înmulțiți numărătorul și numitorul cu dimensiunea imaginii intermediare H’
:
. Astfel, mărirea microscopului este egală cu produsul dintre mărirea obiectivului și mărirea ocularului. Mărirea obiectivului poate fi exprimat prin prisma caracteristicilor microscopului folosind asemănarea triunghiurilor dreptunghiulare 
, Unde L
optic
lungimea tubului: distanța dintre focalizarea din spate a lentilei și focalizarea frontală a ocularului (presupunem că L
>> F despre). Mărirea ocularului
. Prin urmare, mărirea microscopului este: 
.
4. Rezoluția și limita de rezoluție a microscopului. Fenomene de difracție la microscop, conceptul teoriei lui Abbe.
Limita rezoluției microscopuluiz - aceasta este cea mai mică distanță dintre două puncte ale unui obiect privite la microscop, când aceste puncte sunt încă percepute separat. Limita de rezoluție a unui microscop biologic convențional se află în intervalul 3-4 microni. Rezoluţie microscopul este capacitatea de a oferi o imagine separată a două puncte apropiate ale obiectului studiat, adică aceasta este reciproca limitei de rezoluție.
Difracția luminii pune o limită a capacității de a distinge detaliile obiectelor atunci când acestea sunt observate la microscop. Deoarece lumina nu se propagă rectiliniu, ci se îndoaie în jurul obstacolelor (în acest caz, obiectele în cauză), imaginile cu detalii mici ale obiectelor devin neclare.
a sugerat E. Abbe teoria difracției a rezoluției la microscop. Fie ca obiectul pe care vrem să-l examinăm printr-un microscop să fie o rețea de difracție cu o perioadă d. Atunci detaliul minim al obiectului pe care trebuie să-l distingem va fi tocmai perioada rețelei. Difracția luminii are loc pe rețea, dar diametrul obiectivului microscopului este limitat, iar la unghiuri mari de difracție, nu toată lumina care trece prin rețea intră în obiectiv. În realitate, lumina de la un obiect se propagă către lentilă într-un anumit con. Imaginea rezultată este mai aproape de originală, cu atât sunt mai multe maxime implicate în formarea imaginii. Lumina de la un obiect se propagă la lentilă de la un condensator sub formă de con, care se caracterizează prin deschidere unghiulară
u- unghiul la care lentila este vizibilă din centrul obiectului luat în considerare, adică unghiul dintre razele exterioare ale fasciculului luminos conic care intră în sistemul optic. Potrivit lui E. Abbe, pentru a obține o imagine a rețelei, chiar și cea mai neclară, în lentilă trebuie să pătrundă raze de oricare două ordine ale modelului de difracție, de exemplu, razele care formează maximul central și cel puțin primul de difracție. Să reamintim că pentru incidența oblică a razelor pe un rețele de difracție, formula sa principală are forma: . Dacă lumina vine într-un unghi 
, iar unghiul de difracție pentru primul maxim egală 
, atunci formula ia forma 
. Prin urmare, limita de rezoluție a microscopului trebuie luată ca constantă a rețelei de difracție 
, unde este lungimea de undă a luminii.
După cum se poate observa din formulă, o modalitate de a reduce limita de rezoluție a unui microscop este utilizarea luminii cu o lungime de undă mai scurtă. În acest sens, se folosește un microscop cu ultraviolete, în care microobiectele sunt examinate în raze ultraviolete. Designul optic de bază al unui astfel de microscop este similar cu cel al unui microscop convențional. Principala diferență este utilizarea dispozitivelor optice care sunt transparente la lumina UV și caracteristicile de înregistrare a imaginii. Deoarece ochiul nu percepe radiațiile ultraviolete (în plus, arde ochii, adică este periculos pentru organul vizual), se folosesc plăci fotografice, ecrane fluorescente sau convertoare electro-optice.
Dacă un mediu lichid special numit imersiune, atunci scade și limita de rezoluție: 
, Unde n– indicele absolut de refracție de imersie, O
– deschiderea numerică a obiectivului. Apa este folosită ca scufundare ( n
=
1.33), ulei de cedru ( n= 1,515), monobromonaftalină ( n
=
1.66), etc. Pentru fiecare tip de imersie se realizează o lentilă specială, care poate fi folosită numai cu acest tip de imersie.
O altă modalitate de a reduce limita de rezoluție a unui microscop este creșterea unghiului de deschidere. Acest unghi depinde de dimensiunea obiectivului și de distanța de la subiect la obiectiv. Cu toate acestea, distanța de la obiect la lentilă nu poate fi modificată în mod arbitrar, este constantă pentru fiecare lentilă și obiectul nu poate fi apropiat. La microscoapele moderne, unghiul de deschidere atinge 140 o (respectiv, u/2 = 70 o). Cu acest unghi se obțin deschideri numerice maxime și limite minime de rezoluție.
Datele sunt date pentru o incidență oblică a luminii asupra unui obiect și o lungime de undă de 555 nm, la care ochiul uman este cel mai sensibil.
Vă rugăm să rețineți că ocularul nu afectează deloc rezoluția microscopului, ci creează doar o imagine mărită a obiectivului.
Din punct de vedere tehnic, este posibil să se creeze microscoape optice ale căror lentile și oculare vor oferi o mărire totală de 1500-2000 sau mai mult. Cu toate acestea, acest lucru nu este practic, deoarece capacitatea de a distinge detaliile mici ale unui obiect este limitată de fenomenele de difracție. Ca urmare, imaginea celor mai mici detalii ale unui obiect își pierde claritatea, poate apărea o încălcare a similitudinii geometrice a imaginii și a obiectului, punctele învecinate se vor îmbina într-unul singur, iar imaginea poate dispărea complet. Prin urmare, în optică există următoarele concepte care caracterizează calitatea unui microscop:
Rezoluția microscopului- proprietatea unui microscop de a oferi o imagine separată a micilor detalii ale obiectului luat în considerare.
Limită de rezoluție- aceasta este cea mai mică distanță dintre două puncte care sunt vizibile separat la microscop.
Cu cât limita de rezoluție este mai mică, cu atât rezoluția microscopului este mai mare!
Limita de rezoluție determină cea mai mică dimensiune a detaliilor care pot fi distinse într-un specimen folosind un microscop.
Teoria puterii de rezoluție a microscopului a fost elaborată de directorul fabricii K. Zeiss din Jena, profesor de optică E. Abbe (1840-1905). Ca un simplu specimen microscopic, el a luat o rețea de difracție (Fig. 2), a studiat mecanismul de formare a imaginii la microscop și a arătat următoarele.
Să introducem conceptul unghi de deschidere- acesta este unghiul dintre razele exterioare ale unui fascicul de lumină conic care vine din mijlocul obiectului în lentilă (Fig. 3, O). Pentru a crea o imagine, adică pentru a rezolva un obiect, este suficient ca lentila să primească raze care formează doar maxime de ordinul întâi și zero pe cel puțin o parte (Fig. 2 și 3, b). Participarea razelor dintr-un număr mai mare de maxime la formarea imaginii crește calitatea imaginii și contrastul acesteia. Prin urmare, razele care formează aceste maxime trebuie să fie în unghiul de deschidere al lentilei.
 |
a) b) c) d)
1 - lentilă frontală, 2 - lentilă
Astfel, dacă obiectul este un rețele de difracție cu o perioadă d iar lumina cade pe el în mod normal (Fig. 2 și 3, b), atunci razele care formează maxime de ordinul zero și de ordinul întâi pe ambele părți trebuie să participe în mod necesar la formarea imaginii, iar unghiul j 1 este unghiul de deviere al razelor care formează maximul de ordinul întâi, respectiv, ar trebui să fi, în cazuri extreme, egală cu unghiul U/2.
Dacă luăm o zăbrele cu o perioadă mai mică d’, atunci unghiul j’ 1 va fi mai mare decât unghiul U/2 și imaginea nu va apărea. Aceasta înseamnă perioada de rețea d poate fi luată ca limită de rezoluție a microscopului Z. Apoi, folosind formula rețelei de difracție, scriem pentru k=1:
Înlocuirea d pe Z, și j 1 pe U/2, obținem
. (6)
În timpul microscopiei, razele de lumină lovesc un obiect în unghiuri diferite. Cu incidența oblică a razelor (Fig. 3, G) limita de rezoluție scade, deoarece numai razele care formează maxime de ordinul zero și de ordinul întâi pe o parte vor participa la formarea imaginii, iar unghiul j 1 va fi egal cu unghiul de deschidere U. Calculele arată că formula pentru limita de rezoluție în acest caz are următoarea formă:
. (7)
Dacă spațiul dintre obiect și lentilă este umplut cu un mediu de imersie cu indice de refracție n, care este mai mare decât indicele de refracție al aerului, apoi lungimea de undă a luminii l n= l ¤ n. Substituind această expresie în formula pentru limita de rezoluție (7), obținem
, sau 
. (8)
Astfel, formula (7) determină limita de rezoluție pentru un microscop cu o lentilă uscată și formula (8) pentru un microscop cu o lentilă de imersie. Valori sin 0,5 UŞi n× păcat0.5 Uîn aceste formule se numește deschiderea numerică a lentilei și este desemnată prin literă O. Luând în considerare acest lucru, formula pentru limita de rezoluție a unui microscop în formă generală este scrisă după cum urmează:
După cum se poate observa din formulele (8) și (9), rezoluția microscopului depinde de lungimea de undă a luminii, unghiul de deschidere, indicele de refracție al mediului dintre lentilă și obiect, unghiul de incidență al razelor de lumină. de obiect, dar nu depinde de parametrii ocularului. Ocularul nu oferă informații suplimentare despre structura obiectului, nu îmbunătățește calitatea imaginii, ci doar mărește imaginea intermediară.
Rezoluția unui microscop poate fi mărită prin utilizarea imersiei și reducerea lungimii de undă a luminii. Creșterea rezoluției la utilizarea imersiunii poate fi explicată după cum urmează. Dacă există aer între lentilă și obiect (lentila uscată), atunci raza luminoasă, la trecerea din sticlă de acoperire în aer, un mediu cu un indice de refracție mai mic, își schimbă semnificativ direcția ca urmare a refracției, deci mai puține raze intră în lentilă. Când se folosește un mediu de imersie, al cărui indice de refracție este aproximativ egal cu indicele de refracție al sticlei, nu se observă nicio modificare a traseului razelor în mediu și mai multe raze intră în lentilă.
Apa este folosită ca lichid de imersie ( n=1,33), ulei de cedru ( n=1,515), etc. Dacă unghiul maxim de deschidere pentru lentilele moderne ajunge la 140 0, atunci pentru un obiectiv uscat O=0,94, iar pentru o lentilă cu imersie în ulei O=1,43. Dacă în calcul folosim lungimea de undă a luminii l = 555 nm, la care ochiul este cel mai sensibil, atunci limita de rezoluție a unei lentile uscate va fi de 0,30 µm, iar cu imersie în ulei - 0,19 µm. Valoarea numerică a diafragmei este indicată pe cilindrul obiectivului: 0,20; 0,40; 0,65 etc.
Creșterea rezoluției unui microscop optic prin reducerea lungimii de undă a luminii se realizează prin utilizarea radiației ultraviolete. În acest scop, există microscoape speciale cu ultraviolete cu optică de cuarț și dispozitive pentru observarea și fotografiarea obiectelor. Deoarece aceste microscoape folosesc lumină cu o lungime de undă de aproximativ jumătate din cea a luminii vizibile, ele sunt capabile să rezolve structurile medicamentului cu dimensiuni de aproximativ 0,1 μm. Microscopia ultravioletă are un alt avantaj - poate fi folosită pentru a examina preparate nepătate. Majoritatea obiectelor biologice sunt transparente în lumina vizibilă deoarece nu o absorb. Cu toate acestea, au absorbție selectivă în regiunea ultravioletă și, prin urmare, sunt ușor vizibile sub razele ultraviolete.
Un microscop electronic are cea mai mare rezoluție, deoarece lungimea de undă a unui electron care se mișcă este de 1000 de ori mai mică decât lungimea de undă a luminii.
Mărire utilă la microscop limitat de puterea sa de rezoluție și de puterea de rezoluție a ochiului.
Rezoluția ochiului este caracterizată de cel mai mic unghi de vedere la care ochiul uman poate încă distinge două puncte ale unui obiect separat. Este limitată de difracția pe pupilă și de distanța dintre celulele sensibile la lumină ale retinei. Pentru un ochi normal, cel mai mic unghi vizual este de 1 minut. Dacă un obiect este situat la distanța de cea mai bună vedere - 25 cm, atunci acest unghi corespunde unui obiect care măsoară 70 de microni. Această valoare este considerată limita de rezoluție a ochiului liber Z r la cea mai bună distanță de vizualizare. Cu toate acestea, s-a demonstrat că valoarea optimă Z r egal cu 140-280 microni. În acest caz, ochiul suferă cea mai mică încordare.
Mărire utilă la microscop ei o numesc mărirea maximă la care ochiul este încă capabil să distingă detalii egale ca mărime cu limita de rezoluție a microscopului.
Mărirea liniară a unui microscop este egală cu raportul dintre dimensiunea imaginii unui obiect situat la distanța de cea mai bună vedere și dimensiunea obiectului în sine (vezi formula 1). Dacă luăm limita de rezoluție a microscopului ca dimensiune a obiectului Z, iar pentru dimensiunea imaginii - limita de rezoluție a ochiului liber la distanța de cea mai bună vedere Z r, apoi obținem formula pentru mărirea utilă a unui microscop:
Înlocuind în această formulă Z din expresia (9), obținem
. (11)
Înlocuind în formula (11) o lungime de undă a luminii de 555 nm (555×10 -9 m), valorile optime ale limitelor de rezoluție ochilor sunt 140-280 µm (140-280×10 -6 m), găsim gama de valori de mărire utile ale microscopului
500 O < LA n< 1000 O .
De exemplu, atunci când se folosesc cele mai bune obiective de imersie cu o deschidere numerică de 1,43, mărirea utilă va fi de 700-1400, ceea ce arată că nu este practic să se proiecteze microscoape optice cu mărire mare. Cu toate acestea, în prezent, această problemă și-a pierdut urgența din cauza utilizării pe scară largă în biologie și medicină a unui microscop electronic, care oferă o creștere de până la 600.000 și o limită de rezoluție de până la 0,1 nm.
Scopul lucrării. Familiarizarea cu dispozitivul unui microscop și determinarea rezoluției acestuia.
Dispozitive și accesorii: Microscop, placă metalică cu un orificiu mic, oglindă de iluminat, riglă cu scară.
Introducere
Un microscop este format dintr-o lentilă și un ocular, care sunt sisteme complexe de lentile. Calea razelor într-un microscop este prezentată în Fig. 1, în care obiectivul și ocularul sunt reprezentate de lentile unice.
Obiectul în cauză AB este plasat puțin mai departe de focalizarea principală a lentilei F despre. Lentila microscopului oferă o imagine reală, inversă și mărită a obiectului (AB în Fig. 1), care se formează în spatele distanței focale duble a lentilei. Imaginea mărită este privită de ocular ca o lupă. Imaginea unui obiect văzut prin ocular este virtuală, inversă și mărită.
Se numește distanța dintre focalizarea din spate a lentilei și focalizarea frontală a ocularului distanța optică a sistemului sau lungimea tubului optic microscop .
Mărirea unui microscop poate fi determinată de mărirea obiectivului și a ocularului:
N = N aproximativ N aproximativ = ───── (1)
f despre f ok
unde N aproximativ și N aproximativ sunt mărirea lentilei și respectiv a ocularului; D - distanta de cea mai buna vedere pentru un ochi normal (~25 cm); este lungimea optică a tubului microscopului; f despreși f Bine- distanțe focale principale ale lentilei și ocularului.
Când analizăm formula (1), putem concluziona că microscoapele cu mărire mare pot examina orice obiecte mici. Cu toate acestea, mărirea utilă oferită de un microscop este limitată de fenomenele de difracție, care devin vizibile la vizualizarea obiectelor ale căror dimensiuni sunt comparabile cu lungimea de undă a luminii.
Limită de rezoluție microscopul este cea mai mică distanță dintre puncte, a cărei imagine este obținută separat la microscop.
Conform teoriei lui Abbe, limita de rezoluție a unui microscop este determinată de expresia:
d = ───── (2)
unde d este dimensiunea liniară a obiectului în cauză; - lungimea de undă a luminii utilizate; n este indicele de refracție al mediului dintre obiect și lentilă; este unghiul dintre axa optică principală a microscopului și raza de limită (fig. 2).
ÎN 
se numeşte mărimea A = nsin deschiderea numerică a obiectivului
, iar reciproca lui d este rezoluția microscopului
. Din expresia (2) rezultă că rezoluția microscopului depinde de deschiderea numerică a lentilei și de lungimea de undă a luminii care luminează obiectul în cauză.
Dacă obiectul este în aer (n=1), atunci la microscop este posibil să se distingă punctele obiectului, distanța dintre care este:
d = ─────
Pentru obiectele microscopice, unghiul este aproape de 90 de grade, apoi sin 1, ceea ce înseamnă că obiectele situate la o distanță de ~ 0,61 unele de altele pot fi examinate la microscop. În cazul observațiilor vizuale (sensibilitatea maximă a ochiului apare în regiunea verde a spectrului vizibil 550 nm), obiectele situate la o distanță de ~300 nm pot fi văzute la microscop.
După cum rezultă din expresia (2), rezoluția unui microscop poate fi mărită prin reducerea lungimii de undă a luminii care luminează obiectul. Astfel, atunci când fotografiați obiecte în lumină ultravioletă (~ 250-300 nm), rezoluția microscopului poate fi dublată.
După cum știți, o persoană primește cea mai mare parte a informațiilor despre lumea din jurul său prin viziune. Ochiul uman este un dispozitiv complex și perfect. Acest dispozitiv creat de natură funcționează cu lumină - radiație electromagnetică, al cărei interval de lungimi de undă este între 400 și 760 de nanometri. Culoarea pe care o percepe o persoană se schimbă de la violet la roșu.
Undele electromagnetice corespunzătoare luminii vizibile interacționează cu învelișurile electronice ale atomilor și moleculelor din ochi. Rezultatul acestei interacțiuni depinde de starea electronilor din aceste învelișuri. Lumina poate fi absorbită, reflectată sau împrăștiată. Ce s-a întâmplat exact cu lumina poate spune multe despre atomii și moleculele cu care a interacționat. Gama de dimensiuni ale atomilor și moleculelor este de la 0,1 la zeci de nanometri. Aceasta este de multe ori mai scurtă decât lungimea de undă a luminii. Cu toate acestea, obiectele exact de această dimensiune - să le numim nanoobiecte - sunt foarte importante de văzut. Ce trebuie făcut pentru asta? Să discutăm mai întâi ce poate vedea ochiul uman.
De obicei, când se vorbește despre rezoluția unui anumit dispozitiv optic, aceștia funcționează cu două concepte. Unul este rezoluția unghiulară, iar celălalt este rezoluția liniară. Aceste concepte sunt interconectate. De exemplu, pentru ochiul uman, rezoluția unghiulară este de aproximativ 1 minut de arc. În acest caz, ochiul poate distinge două obiecte punctuale situate la 25–30 cm distanță de el numai atunci când distanța dintre aceste obiecte este mai mare de 0,075 mm. Aceasta este destul de comparabilă cu rezoluția unui scaner de computer convențional. De fapt, rezoluția de 600 dpi înseamnă că scanerul poate distinge puncte la distanță de până la 0,042 mm.
Pentru a putea distinge obiectele aflate la distanțe și mai mici unele de altele, a fost inventat un microscop optic - un dispozitiv care mărește rezoluția ochiului. Aceste dispozitive arată diferit (după cum se poate vedea din Figura 1), dar principiul lor de funcționare este același. Microscopul optic a făcut posibilă împingerea limitei de rezoluție la fracții de micron. Deja cu 100 de ani în urmă, microscopia optică a făcut posibilă studierea obiectelor de dimensiuni micron. Cu toate acestea, în același timp, a devenit clar că este imposibil să se obțină o creștere suplimentară a rezoluției prin simpla creștere a numărului de lentile și îmbunătățirea calității acestora. Rezoluția unui microscop optic s-a dovedit a fi limitată de proprietățile luminii în sine, și anume natura ondulatorie.
La sfârșitul secolului înainte de trecut, sa stabilit că rezoluția unui microscop optic este de . În această formulă, λ este lungimea de undă a luminii și n păcat u- deschiderea numerică a lentilei microscopului, care caracterizează atât microscopul cât și substanța care se află între obiectul de studiu și lentila microscopului cea mai apropiată de acesta. Într-adevăr, expresia pentru deschiderea numerică include indicele de refracție n mediul dintre obiect și lentilă și unghiul uîntre axa optică a lentilei și razele cele mai exterioare care ies din obiect și pot intra în acea lentilă. Indicele de refracție al vidului este egal cu unitatea. Pentru aer acest indicator este foarte aproape de unitate, pentru apă este 1,33303, iar pentru lichidele speciale utilizate în microscopie pentru a obține rezoluția maximă, n ajunge la 1,78. Oricare ar fi unghiul u, valoarea sin u nu poate fi mai mult de unul. Astfel, rezoluția unui microscop optic nu depășește o fracțiune din lungimea de undă a luminii.
Rezoluția este în general considerată a fi jumătate din lungimea de undă.
Intensitatea, rezoluția și mărirea unui obiect sunt lucruri diferite. Puteți face astfel încât distanța dintre centrele imaginilor obiectelor care sunt situate la 10 nm unul de celălalt să fie de 1 mm. Aceasta ar corespunde unei creșteri de 100.000 de ori. Cu toate acestea, nu va fi posibil să distingem dacă este un obiect sau două. Cert este că imaginile obiectelor ale căror dimensiuni sunt foarte mici în comparație cu lungimea de undă a luminii vor avea aceeași formă și dimensiune, independent de forma obiectelor în sine. Astfel de obiecte sunt numite obiecte punctuale - dimensiunile lor pot fi neglijate. Dacă un astfel de obiect punctual strălucește, atunci un microscop optic îl va reprezenta ca un cerc de lumină înconjurat de inele deschise și întunecate. În continuare, pentru simplitate, vom lua în considerare sursele de lumină. O imagine tipică a unei surse de lumină punctiforme obținută cu ajutorul unui microscop optic este prezentată în Figura 2. Intensitatea inelelor de lumină este mult mai mică decât cea a cercului și scade odată cu distanța de la centrul imaginii. Cel mai adesea, doar primul inel luminos este vizibil. Diametrul primului inel întunecat este de . Funcția care descrie această distribuție a intensității se numește funcție de împrăștiere punct. Această funcție nu depinde de mărirea. Imaginea mai multor obiecte punctuale va fi exact cercuri și inele, așa cum se poate vedea din Figura 3. Imaginea rezultată poate fi mărită, totuși, dacă imaginile a două obiecte punctiforme învecinate se îmbină, acestea vor continua să se îmbine. Se spune adesea că acest tip de mărire este inutil - imaginile mai mari vor fi pur și simplu mai neclare. Un exemplu de mărire inutilă este prezentat în Figura 4. Formula este adesea numită limită de difracție și este atât de faimoasă încât a fost sculptată pe monumentul autorului acestei formule, fizicianul optic german Ernst Abbe.
Desigur, de-a lungul timpului, microscoapele optice au început să fie echipate cu o varietate de dispozitive care au făcut posibilă stocarea imaginilor. Ochiul uman a fost completat mai întâi de camere cu film și filme, iar apoi de camere bazate pe dispozitive digitale care convertesc lumina care cădea asupra lor în semnale electrice. Cele mai comune dintre aceste dispozitive sunt matricele CCD (CCD înseamnă dispozitiv cuplat cu încărcare). Numărul de pixeli din camerele digitale continuă să crească, dar acest lucru singur nu poate îmbunătăți rezoluția microscoapelor optice.
Chiar și acum douăzeci și cinci de ani părea că limita de difracție era de netrecut și că pentru a studia obiectele ale căror dimensiuni sunt de multe ori mai mici decât lungimea de undă a luminii, era necesar să se abandoneze lumina ca atare. Exact aceasta este calea pe care au luat-o creatorii microscoapelor electronice și cu raze X. În ciuda numeroaselor avantaje ale unor astfel de microscoape, problema utilizării luminii pentru vizualizarea nanoobiectelor a rămas. Au existat multe motive pentru aceasta: comoditatea și ușurința de a lucra cu obiecte, timpul scurt necesar pentru a obține o imagine, metode cunoscute de colorare a mostrelor și multe altele. În cele din urmă, după ani de muncă grea, a devenit posibilă vizualizarea obiectelor la scară nanometrică folosind un microscop optic. Cel mai mare progres în această direcție a fost realizat în domeniul microscopiei cu fluorescență. Desigur, nimeni nu a anulat limita de difracție, dar au reușit să o ocolească. În prezent, există diverse microscoape optice care fac posibilă examinarea obiectelor ale căror dimensiuni sunt mult mai mici decât lungimea de undă a însăși luminii care creează imagini ale acestor obiecte. Toate aceste dispozitive au un principiu comun. Să încercăm să explicăm care este.
Din ceea ce s-a spus deja despre limita de difracție a rezoluției, este clar că a vedea o sursă punctuală nu este atât de dificilă. Dacă această sursă este de o intensitate suficientă, imaginea ei va fi clar vizibilă. Forma și dimensiunea acestei imagini, așa cum sa menționat deja, vor fi determinate de proprietățile sistemului optic. În același timp, cunoscând proprietățile sistemului optic și fiind sigur că obiectul este un obiect punctual, puteți determina exact unde se află obiectul. Precizia determinării coordonatelor unui astfel de obiect este destul de mare. Acest lucru poate fi ilustrat în Figura 5. Coordonatele unui obiect punctual pot fi determinate cu mai multă precizie, cu atât strălucește mai intens. În anii 80 ai secolului trecut, folosind un microscop optic, ei au putut determina poziția moleculelor luminoase individuale cu o precizie de 10-20 nanometri. O condiție necesară pentru o determinare atât de precisă a coordonatelor unei surse punctuale este singurătatea acesteia. Cea mai apropiată altă sursă punctuală trebuie să fie atât de departe încât cercetătorul să știe cu siguranță că imaginea procesată corespunde unei singure surse. Este clar că aceasta este o distanță l trebuie să îndeplinească condiția. În acest caz, analiza imaginii poate oferi date foarte precise despre poziția sursei în sine.
Majoritatea obiectelor ale căror dimensiuni sunt mult mai mici decât rezoluția unui microscop optic pot fi reprezentate ca un set de surse punctuale. Sursele de lumină dintr-un astfel de set sunt situate una față de alta la distanțe mult mai mici decât . Dacă aceste surse strălucesc simultan, atunci va fi imposibil să spunem ceva despre locul exact în care se află. Cu toate acestea, dacă puteți face aceste surse să strălucească pe rând, atunci poziția fiecăreia dintre ele poate fi determinată cu mare precizie. Dacă această precizie depășește distanța dintre surse, atunci, cunoscând poziția fiecăreia dintre ele, se poate afla care sunt pozițiile lor relative. Aceasta înseamnă că au fost obținute informații despre forma și dimensiunea obiectului, care sunt prezentate ca un set de surse punctuale. Cu alte cuvinte, în acest caz, puteți examina un obiect cu un microscop optic ale cărui dimensiuni sunt mai mici decât limita de difracție!
Astfel, punctul cheie este obținerea de informații despre diferite părți ale unui nanoobiect independent unele de altele. Există trei grupuri principale de metode pentru a face acest lucru.
Primul grup de metode face ca una sau alta parte a obiectului studiat să strălucească. Cea mai cunoscută dintre aceste metode este microscopia optică cu scanare în câmp apropiat. Să aruncăm o privire mai atentă.
Dacă studiezi cu atenție condițiile care sunt implicate când vine vorba de limita de difracție, vei descoperi că distanțele de la obiecte la lentile sunt mult mai mari decât lungimea de undă a luminii. La distanțe comparabile și mai mici decât această lungime de undă, imaginea este diferită. În apropierea oricărui obiect prins în câmpul electromagnetic al unei unde luminoase, există un câmp electromagnetic alternativ, a cărui frecvență de schimbare este aceeași cu frecvența de schimbare a câmpului în unda luminoasă. Spre deosebire de unda luminoasă, acest câmp se degradează rapid pe măsură ce se îndepărtează de nanoobiect. Distanța la care scade intensitatea, de ex. e ori, comparabil cu dimensiunea obiectului. Astfel, câmpul electromagnetic de frecvență optică se dovedește a fi concentrat într-un volum de spațiu, a cărui dimensiune este mult mai mică decât lungimea de undă a luminii. Orice nanoobiect care cade în această zonă va interacționa într-un fel sau altul cu câmpul concentrat. Dacă obiectul cu ajutorul căruia se realizează această concentrare a câmpului este deplasat secvenţial de-a lungul oricărei traiectorii de-a lungul nanoobiectului studiat și este înregistrată lumina emisă de acest sistem, atunci o imagine poate fi construită din puncte individuale situate pe această traiectorie. Desigur, în fiecare punct imaginea va arăta așa cum se arată în Figura 2, dar rezoluția va fi determinată de cât de mult a fost concentrat câmpul. Și aceasta, la rândul său, este determinată de dimensiunea obiectului cu ajutorul căruia este concentrat acest câmp.
Cel mai obișnuit mod de a concentra câmpul în acest fel este de a face o gaură foarte mică într-un ecran metalic. De obicei, această gaură este situată la capătul unui ghidaj de lumină ascuțit acoperit cu o peliculă subțire de metal (ghidul de lumină este adesea numit fibră optică și este utilizat pe scară largă pentru transmiterea datelor pe distanțe lungi). Acum este posibil să se producă găuri cu diametre de la 30 la 100 nm. Rezoluția este aceeași ca dimensiune. Dispozitivele care funcționează pe acest principiu se numesc microscoape optice cu scanare în câmp apropiat. Au apărut acum 25 de ani.
Esența celui de-al doilea grup de metode se rezumă la următoarele. În loc să faceți nanoobiectele învecinate să strălucească la rândul lor, puteți utiliza obiecte care strălucesc în culori diferite. În acest caz, cu ajutorul filtrelor de lumină care transmit lumină de o culoare sau alta, puteți determina poziția fiecărui obiect și apoi creați o singură imagine. Acest lucru este foarte asemănător cu ceea ce este arătat în Figura 5, doar culorile vor fi diferite pentru cele trei imagini.
Ultimul grup de metode care fac posibilă depășirea limitei de difracție și examinarea nanoobiectelor utilizează proprietățile obiectelor luminoase în sine. Există surse care pot fi „pornite” și „oprite” folosind o lumină special selectată. Astfel de comutări apar statistic. Cu alte cuvinte, dacă există multe nanoobiecte comutabile, atunci selectând lungimea de undă a luminii și intensitatea acesteia, puteți forța doar unele dintre aceste obiecte să se „oprească”. Obiectele rămase vor continua să strălucească și de la ele se poate obține o imagine. După aceasta, trebuie să „porniți” toate sursele și să „dezactivați” din nou unele dintre ele. Setul de surse care rămân „pornit” va fi diferit de setul care a rămas „pornit” prima dată. Repetând această procedură de mai multe ori, puteți obține un set mare de imagini care diferă unele de altele. Analizând o astfel de mulțime, este posibilă localizarea unei proporții mari din toate sursele cu o precizie foarte mare, cu mult peste limita de difracție. Un exemplu de super-rezoluție obținută în acest mod este prezentat în Figura 6.
Microscopia optică de super-rezoluție se dezvoltă în prezent rapid. Este sigur să presupunem că acest domeniu va atrage un număr tot mai mare de cercetători în următorii ani și sperăm că printre ei se vor număra și cititorii acestui articol.
Orientări
Pentru a studia obiecte de dimensiuni mici și care nu se pot distinge cu ochiul liber, se folosesc instrumente optice speciale - microscoape. În funcție de scop, ele se disting: simplificate, de lucru, de cercetare și universale. În funcție de sursa de iluminare utilizată, microscoapele se împart în: lumină, fluorescent, ultraviolete, electronice, neutroni, scanare, tunel. Designul oricăruia dintre microscoapele enumerate include părți mecanice și optice. Partea mecanică servește la crearea condițiilor de observație - plasarea obiectului, focalizarea imaginii, partea optică - obținerea unei imagini mărite.
Dispozitiv de microscop cu lumină
Un microscop se numește microscop cu lumină deoarece oferă capacitatea de a studia un obiect în lumină transmisă într-un câmp vizual luminos. (Fig. Vedere externă a Biomed 2) prezintă o vedere generală a microscopului Biomed-2.
|
|
Partea mecanică a microscopului constă dintr-o bază de microscop, o treaptă mobilă și un dispozitiv rotativ.
Concentrarea asupra unui obiect se realizează prin deplasarea scenei prin rotirea butoanelor de reglare grosieră și fină.
Intervalul de focalizare grosier al microscopului este de 40 mm.
Condensatorul este montat pe un suport și este situat între treapta obiect și lentila colectorului. Mișcarea acestuia se face prin rotirea butonului de reglare a înălțimii condensatorului. Vederea sa generală este prezentată în (Fig.???) Un condensator cu două lentile cu o deschidere de 1,25 asigură iluminarea câmpurilor de pe obiect atunci când se lucrează cu lentile cu mărire de la 4 la 100 de ori.
Masa cu obiecte este montată pe un suport. Mișcarea coordonată a mesei cu obiecte este posibilă prin rotirea mânerelor. Obiectul este fixat pe masă folosind suporturi pentru medicamente. Suporturile pot fi mutate unul față de celălalt.
Coordonatele obiectului și cantitatea de mișcare sunt măsurate pe scale cu o valoare a diviziunii de 1 mm și vernieri cu o valoare a diviziunii de 0,1 mm. Intervalul de mișcare a obiectului în direcția longitudinală este de 60 mm, în direcția transversală – 40 mm. Condensator
Condensator
Microscopul este echipat cu o unitate de montare a condensatorului cu posibilitatea de centrare si focalizare a miscarii.
Microscopul de bază folosește un condensator universal instalat într-un suport; la utilizarea uleiului de imersie, deschiderea numerică este de 1,25.
La ajustarea luminii, se efectuează o schimbare lină a deschiderii numerice a fasciculului de raze care iluminează medicamentul folosind diafragma de deschidere.
Condensatorul este instalat în suportul condensatorului într-o poziție fixă și fixat cu un șurub de blocare.
Șuruburile de centrare a condensatorului sunt utilizate în timpul procesului de ajustare a iluminării pentru a muta condensatorul într-un plan perpendicular pe axa optică a microscopului în timp ce se centrează imaginea diafragmei de câmp în raport cu marginile câmpului vizual.
Mânerul în sus și în jos al condensatorului, situat în partea stângă a suportului de suport al condensatorului, este utilizat la reglarea luminii pentru a focaliza imaginea diafragmei de câmp.
Filtrele sunt instalate într-un inel rotativ situat în partea de jos a condensatorului.
Partea optică a microscopului
Constă din sisteme de iluminare și observare. Sistemul de iluminare luminează uniform câmpul vizual. Sistemul de observare este conceput pentru a mări imaginea obiectului observat.
Sistem de iluminat
Este situat sub masa cu obiecte. Este alcătuit dintr-o lentilă colectoare instalată în corp, care este înșurubat în orificiul de la baza microscopului și o priză cu o lampă instalată în ea. Soclul lămpii este instalat în interiorul bazei microscopului. Iluminatorul microscopului este alimentat de la o rețea de curent alternativ printr-un cablu de alimentare cu trei pini conectat la sursa de alimentare folosind o mufă. Lampa de iluminare este aprinsă de un comutator situat pe baza microscopului.
Sistem de observare
Constă din lentile, atașament monocular și oculare.
Lentile
Lentilele alcătuiesc cea mai importantă, mai valoroasă și fragilă parte a microscopului. Mărirea, rezoluția și calitatea imaginii depind de ele. Sunt un sistem de lentile centrate reciproc, închise într-un cadru metalic. La capatul superior al cadrului se afla un filet cu care obiectivul este montat in soclul revolverului. Lentila frontală (cel mai apropiată de obiect) din lentilă se numește lentilă frontală și este singura din lentilă care produce mărire. Toate celelalte lentile obiective sunt numite lentile de corecție și servesc la corectarea deficiențelor imaginii optice.
Când un fascicul de raze de lumină cu lungimi de undă diferite trece prin lentile, apare o colorare curcubeu a imaginii - aberație cromatică. Refracția neuniformă a razelor pe suprafața curbată a lentilei duce la aberația sferică, care apare din cauza refracției neuniforme a razelor centrale și periferice. Ca rezultat, imaginea cu puncte apare ca un cerc neclar.
Lentilele incluse în kit-ul de microscop sunt proiectate pentru o lungime a tubului optic de 160 mm, o înălțime de 45 mm și o grosime a sticlei de acoperire de mm.
Obiectivele cu măriri mai mari de 10X sunt echipate cu rame cu arc care protejează specimenul și lentilele frontale de deteriorare la focalizarea pe suprafața specimenului.
Un inel colorat poate fi aplicat pe corpul lentilei în conformitate cu mărirea, precum și:
- deschidere numerică;
- lungime tub optic 160;
- grosimea sticlei de acoperire 0,17, 0 sau -";
- tip de imersie - ulei ULEI (MI) sau apa VI;
Obiectivele marcate cu 0,17 sunt destinate studierii preparatelor numai cu pahare de acoperire de 0,17 mm grosime. Obiectivele marcate cu 0 sunt concepute pentru studierea preparatelor numai fără ochelari de protecție. Obiectivele cu mărire redusă (2,5 - 10), precum și obiectivele de imersie, pot fi utilizate la examinarea preparatelor cu sau fără un geam de acoperire. Aceste lentile sunt marcate cu o pictogramă －.
Oculare
Ocularul microscopului este format din două lentile: lentila oculară (superioară) și lentila colectoare (inferioară). Între lentile se află diafragma. Diafragma blochează razele laterale și le transmite pe cele apropiate de axa optică, ceea ce sporește contrastul imaginii. Scopul ocularului este de a mări imaginea produsă de obiectiv. Ocularele au propria lor mărire de ×5, ×10, ×12,5, ×16 și ×20, care este indicată pe cadru.
Alegerea ocularelor depinde de setul de lentile utilizate. Atunci când lucrați cu lentile acromate, acrostigmate și acrofluare, este recomandabil să folosiți oculare cu un câmp vizual liniar de cel mult 20 mm, cu lentile planchromat și planapocromate - oculare cu un câmp vizual liniar de 20; 22 și 26,5 mm.
În plus, microscopul poate fi echipat cu un ocular WF10/22 cu o scală; valoarea diviziunii scalei este de 0,1 mm.
Caracteristicile microscoapelor
Mărirea microscopului
Principalele caracteristici ale unui microscop includ mărirea și rezoluția. Mărirea totală furnizată de un microscop este definită ca produsul dintre mărirea obiectivului și mărirea ocularului. Cu toate acestea, mărirea nu indică calitatea imaginii, aceasta poate fi clară sau neclară. Claritatea imaginii rezultate este caracterizată de rezoluția microscopului, adică. cea mai mică dimensiune a obiectelor sau părților acestora care pot fi văzute folosind acest dispozitiv.
Mărirea totală Г a microscopului în timpul observației vizuale este determinată de formula: Г = βok × βok, unde:
βrev - mărirea lentilei (marcată pe lentilă);
βok - mărire a ocularului (marcat pe ocular).
| Tabelul 3 | Mărirea obiectivului Mărirea microscopului și câmpul observat |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5/26* | 10/22 | 15/16* | ||||
| pe un obiect cu un ocular: | G | pe un obiect cu un ocular: | G | pe un obiect cu un ocular: | G | |
| 4 | 20 | 4,0 | 50 | 4,5 | 64 | 3,75 |
| 10 | 50 | 2,0 | 100 | 1,8 | 160 | 1,5 |
| 20 | 100 | 1,0 | 200 | 0,9 | 320 | 0,75 |
| 40 | 200 | 0,5 | 420 | 0,45 | 640 | 0,38 |
| 100 | 500 | 0,2 | 1000 | 0,18 | 1600 | 0,15 |
- Adăugați, mm
Rezoluția microscopului
Rezoluția unui microscop este determinată de distanța minimă (de rezoluție) dintre două puncte (sau două linii mai subțiri) vizibile separat și este calculată prin formula
D=λ/(A1+A2), unde d este distanța minimă (rezoluție) dintre două puncte (linii);
λ este lungimea de undă a luminii utilizate;
A1 și A2 sunt diafragma numerică a lentilei (marcate pe cadru) și a condensatorului.
Puteți crește rezoluția (adică reduceți valoarea absolută a lui d, deoarece acestea sunt valori reciproce) în următoarele moduri: iluminați obiectul cu lumină cu o lungime de undă mai scurtă λ (de exemplu, raze ultraviolete sau cu undă scurtă), utilizați lentile cu o deschidere mai mare A1 sau măriți condensatorul de diafragmă A2.
Distanța de lucru a obiectivului
Microscoapele sunt echipate cu patru obiective detașabile cu propriile măriri de 4×, 10×, 40× și 100×, marcate pe un cadru metalic. Mărirea lentilei depinde de curbura lentilei frontale principale: cu cât curbura este mai mare, cu atât distanța focală este mai mică și mărirea este mai mare. Acest lucru trebuie reținut la microscopie - cu cât mărirea oferită de lentilă este mai mare, cu atât distanța de lucru liberă este mai mică și cu atât trebuie coborâtă mai jos deasupra planului specimenului.
Imersiune
Toate lentilele sunt împărțite în uscate și imersibile sau submersibile. O lentilă se numește uscată dacă există aer între lentila frontală și specimenul în cauză. În acest caz, din cauza diferenței dintre indicele de refracție al sticlei (1,52) și al aerului (1,0), unele dintre razele de lumină sunt deviate și nu intră în ochiul observatorului. Lentilele cu sistem uscat au de obicei o distanță focală mare și oferă o mărire scăzută (10x) sau medie (40x).
Microscopul este conectat la rețeaua electrică folosind un cablu de alimentare. Folosind un revolver, pe calea fasciculului este instalată o lentilă cu o mărire de ×10. O ușoară oprire și sunetul de clic al arcului revolverului indică faptul că obiectivul este instalat de-a lungul axei optice. Folosind butonul de focalizare grosieră, coborâți obiectivul la o distanță de 0,5 - 1,0 cm de scenă.
Reguli pentru lucrul cu lentile uscate.
Preparatul pregătit se așează pe scenă și se fixează cu o clemă. Câmpurile vizuale multiple sunt vizualizate folosind o lentilă uscată ×10. Scena este mutată folosind șuruburi laterale. Zona medicamentului necesară examinării este plasată în centrul câmpului vizual. Ridicați tubul și, prin rotirea revolverului, mutați lentila cu o mărire de ×40, observând din lateral, cu ajutorul unui șurub macrometric, coborâți din nou tubul cu lentila aproape până când intră în contact cu specimenul. Priviți în ocular și ridicați foarte încet tubul până când apare conturul imaginii. Focalizarea precisă se realizează folosind un șurub micrometru, rotindu-l într-o direcție sau alta, dar nu mai mult de o tură completă. Dacă se simte rezistență la rotirea șurubului micrometru, înseamnă că cursa acestuia a fost finalizată. În acest caz, rotiți șurubul cu una sau două ture complete în direcția opusă, găsiți din nou imaginea folosind șurubul macrometric și continuați să lucrați cu șurubul micrometric.
Este util să vă obișnuiți să țineți ambii ochi deschiși atunci când microscopați și să-i folosiți alternativ, deoarece acest lucru vă va obosi mai puțin vederea.
Când schimbați lentilele, nu trebuie uitat că rezoluția microscopului depinde de raportul dintre deschiderea lentilei și condensatorul. Diafragma numerică a obiectivului cu mărire ×40 este de 0,65, iar cea a condensatorului neimersat este de 0,95. Ele pot fi aliniate practic prin următoarea tehnică: după focalizarea specimenului cu lentila, scoateți ocularul și, privind prin tub, acoperiți diafragma irisului condensatorului până când marginile acestuia devin vizibile la marginea spatelui iluminat uniform. lentila lentilei. În acest moment, deschiderile numerice ale condensatorului și ale obiectivului vor fi aproximativ egale.
Reguli pentru lucrul cu o lentilă de imersie.
Pe preparat se aplică o picătură mică de ulei de imersie (de preferință fixată și colorată). Revolverul este rotit și o lentilă de imersie cu o mărire de 100× este instalată de-a lungul axei optice centrale. Condensatorul este ridicat până când se oprește. Diafragma irisului condensatorului este deschisă complet. Privind din lateral, utilizați un șurub macrometric pentru a coborî tubul până când lentila este scufundată în ulei, aproape până când lentila intră în contact cu lama specimenului. Acest lucru trebuie făcut cu mare atenție pentru ca lentila frontală să nu se miște și să nu se deterioreze. Ei privesc în ocular, rotesc foarte încet șurubul macrometric spre ei înșiși și, fără a ridica lentila din ulei, ridică tubul până când apar contururile obiectului. Trebuie reținut că distanța liberă de lucru în lentila de imersie este de 0,1 - 0,15 mm. Apoi focalizarea precisă se face folosind un șurub macrometric. În pregătire sunt examinate mai multe câmpuri vizuale, deplasând masa cu șuruburi laterale. După terminarea lucrului cu lentila de imersie, ridicați tubul, îndepărtați preparatul și ștergeți cu grijă lentila frontală a lentilei, mai întâi cu un șervețel uscat din bumbac moale, apoi cu același șervețel, dar ușor umezit cu benzină pură. Uleiul nu trebuie lăsat pe suprafața lentilei, deoarece permite praful să se depună și poate duce la deteriorarea opticii microscopului în timp. Preparatul este eliberat de ulei mai întâi cu o bucată de hârtie de filtru, apoi sticla este tratată cu benzină sau xilen.
Încărcare...
